質(zhì)粒提取過程中需要注意的細(xì)節(jié)

質(zhì)粒(plasmid) 廣泛存在于生物界，從細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人類機(jī)體中都含有。質(zhì)粒是細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體（或擬核）以外的DNA分子，存在于細(xì)胞質(zhì)中（但酵母除外，酵母的2 μm質(zhì)粒存在于細(xì)胞核中），具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息，是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。質(zhì)粒具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。細(xì)菌質(zhì)粒是DNA重組技術(shù)中常用的載體。載體是指把一個有用的外源基因通過基因工程手段，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行增殖和表達(dá)的工具。將某種目標(biāo)基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。

目前有許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒 DNA ， 這些方法都主要包括有以下 3 個步驟：

1. 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長。

2. 細(xì)菌的收獲和裂解

3. 質(zhì)粒 DNA 的純化。

（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長

從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中 (有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如 pUC 系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn) LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地擴(kuò)增質(zhì)粒 DNA 。然而，較長一代的載體 (如 pBR322) 由于不能如此自由地復(fù)制， 所以需要在得到部分生長的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時， 以便對質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。 氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成， 結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制， 然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制， 在若干小時內(nèi)， 其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。 這樣，像 pBR ３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素 μg/ml) 已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒 DNA 量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

（二）細(xì)菌的收獲和裂解

細(xì)菌的收獲可通過離心來進(jìn)行， 而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種， 這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、 有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。 選擇哪一種方法取決于３個因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒 DNA 的技術(shù)。

1)大質(zhì)粒 (大于 15kb) 容易受損， 故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。 將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和 EDTA 進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入 SDS 一類去污劑溶解球形體。 這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。

2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入 EDTA 后，有時還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌

暴露于去污劑， 通過煮沸或堿處理使之裂解。 這些處理可破壞堿基配對， 故可使宿主的線狀染色體 DNA 變性，但閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒 DNA 鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。

3)一些大腸桿菌菌株 (如 HB101 的一些變種衍生株 ) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類， 當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。 糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒 DNA 內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如 HB101 和 TG1 等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。

4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶 A 的大腸桿菌菌株 (endA+ 株，如 HB101) 中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。 因為煮沸不能*滅活內(nèi)切核酸酶 A，以后在溫育 (如用限制酶消化 )時，質(zhì)粒 DNA 會被降解。但如果通過一個附加步驟 (用酚：氯仿進(jìn)行抽提 )可以避免此問題。

(三)質(zhì)粒 DNA 的純化

常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒 DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體 DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán) DNA 分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與 DNA 結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀 DNA 的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限， 可繼續(xù)結(jié)合更多的染料， 直至達(dá)到飽和 ( 每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子 ) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán) DNA 分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。 多年來， 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒 DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒。

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