細胞凋亡檢測技術(shù)與方法

具體來說，針對凋亡的不同階段有以下一些方法：  

1．早期檢測:  

1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:  

PS從細胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生,可能作為免疫系統(tǒng)的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標記凋亡的發(fā)展階段。  

BioVision公司位于美國加州，是世界上專著于凋亡和細胞信號研究的公司。其產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)、價廉、包裝使用方便。BioVision提供多種標記的AnnexinV產(chǎn)品，并有與核染料PI組成完整早期凋亡檢測試劑盒。  

2）細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：  

正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當細胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時，細胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯(lián)反應。  

由于GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。  

3）細胞色素C的定位檢測  

細胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結(jié)合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動caspase級聯(lián)反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。  

細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。CytochromecApoptosisAssayKit試劑盒可以有效地檢測凋亡過程中細胞色素c的釋放情況。  

4)線粒體膜電位變化的檢測：  

在凋亡研究的早期，從形態(tài)學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。Biovision公司的MitoCaptureTMMitochondrialApoptosisDetectionKit（MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測試劑盒）可以簡單、靈敏地體外分析、檢測線粒體在凋亡過程中的變化。  

2．晚期檢測：  

細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200bp的DNA片段。  

1）凋亡DNALadder檢測試劑盒  

細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。QuickApoptoticDNALadderDetectionKit可以快速（約1-2小時）、靈敏地檢測凋亡細胞中的DNA片段。  

2）TUNEL-basedDNA片段分析試劑盒  

細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測。Apo-BrdUTM分析使用2種顏色的TUNEL方法用流式細胞儀檢測凋亡細胞中DNA條帶。采用的BrdU比生物素標記的或（digoxigenylated）標記的方法靈敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一種完整的試劑盒用于雙色的免疫組化（IHC）檢測DNA片段。Apo-DIRECTTM是非常簡單的一步標記凋亡細胞，用于流式細胞術(shù)分析。  

3）Caspase分析試劑和試劑盒  

Caspase在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，屬于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。在正常狀態(tài)下，caspase家族都以無活性的酶原(30～50kD)形式表達，Caspase酶原由原結(jié)構(gòu)域、大亞基（～20kD）和小亞基(～10kD)構(gòu)成。當細胞發(fā)生凋亡時caspase可以被蛋白酶裂解，大亞基和小亞基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase級聯(lián)反應，促發(fā)細胞凋亡。