Peprotech細(xì)胞因子溶解稀釋常見問題

Peprotech的細(xì)胞因子或重組蛋白以凍干粉的形式提供，無任何添加劑、賦形劑及蛋白載體，這使得細(xì)胞因子或重組蛋白非常穩(wěn)定，在-20℃或-80℃可穩(wěn)定保存數(shù)年，并且使用非常安全，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，以溶液的形式加入到培養(yǎng)體系或注入動(dòng)物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，溶解不好會導(dǎo)致細(xì)胞因子或重組蛋白的活性降低或喪失，這也是許多客戶經(jīng)常遇到的問題。

那么應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？

下面以Recombinant Human IL-4（重組人IL-4，產(chǎn)品編號：200-04）的說明書（COA）為例，對細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。

拿到重組人IL-4的說明書后，您會發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution（重懸）的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：開蓋前離心試劑管

PeproTech 的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完·全溶解。

有很多用戶會問一個(gè)問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時(shí)間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？

答：有些小型高速離心機(jī)（多為進(jìn)口品牌）的面板上有一個(gè) Spin 鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會自動(dòng)快速上升到其最·大速度(10000rpm 或 12000rpm)，上升到最·高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個(gè)過程大約 30s。這個(gè) Spin 鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。

但有些實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的高速離心機(jī)，只有最·高轉(zhuǎn)速為 4000-4500rpm 的離心機(jī)。這種情況下，需 3000-3500rpm 離心 5min，也能達(dá)到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。

這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。

1）一定要用推薦的溶液重懸（或溶解）凍干粉

用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解，而重組人 IL-2 （產(chǎn)品編號：200-02）則需用 100mM Acetic Acid （醋酸）溶解，重組人TGF-beta1 （產(chǎn)品編號：100-21）需用 10mMCitric Acid（檸檬酸），pH3.0 溶解，重組人FGF-basic（產(chǎn)品編號：100-18B）需用 5mMTris，pH7.6 溶解，重組人FGF-10（產(chǎn)品編號：100-26）需用5mMSodium Phosphate（磷酸鈉），pH7.4 溶解，重組IL-13（產(chǎn)品編號：200-13）需用 20mMMHCl溶解。（注：即使同一重組細(xì)胞 因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。 具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的官·方說明書為準(zhǔn)）。

經(jīng)常會有客戶問，為什么有多種溶解方法？

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是 pH 值和離子強(qiáng)度。PeproTech 的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完·全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH 值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完·全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用 PBS 或培養(yǎng)液（1640或 DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech 的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是 PBS，此時(shí)千萬不能用 PBS 或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人 KGF(產(chǎn)品編號：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號：100-52)等，說明書上的溶解液即為 1x PBS，此時(shí)用 PBS溶解完·全沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過最·好還是用先用 PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。

2）一定要溶解到指定的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為 0.1-1.0 mg/ml。這個(gè)濃度范圍對于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6（產(chǎn)品編號：100-30）為 0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B（產(chǎn)品編號：120-15）則一定要是0.5mg/ml。

高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢？

答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會超過該蛋白的最·大溶解濃度，即蛋白無法完·全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集（aggregation），最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。

3）一定不能振蕩(vortex)。

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。

有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的完·全溶解，該怎么辦呢？

答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白完·全溶解。對于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech 會在說明書中進(jìn)行備注（Note）。如在重組人 IL-13（產(chǎn)品編號：200-13）的說明書中您會看到：Slow to dissolve （緩慢溶解），在重組人 IL-11（產(chǎn)品編號：200-11）的說明中會看到：This solution is slow to dissolve.（該溶液溶解緩慢）。這種情況下，您最·好能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床（shaker）上低速搖一段時(shí)間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白完·全溶解。有些蛋白，如重組人 IL-13 Variant （產(chǎn)品編號：200-13A）雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use.（將重懸液在 4℃靜置2小時(shí)以上）。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第3步：該重懸液在2-8℃最長可保存1周。

用說明書上推薦的溶液重懸細(xì)胞因子或重組蛋白至推薦的濃度后，可置于2-8℃儲存，在此條件下其活性最長可保持1周。這對于周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC（樹突狀細(xì)胞）的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白重懸液加入到培養(yǎng)體系即可。一般說明書上推薦的重懸濃度要高于實(shí)驗(yàn)時(shí)使用的濃度，此時(shí)可能需要對重懸后的溶液進(jìn)行稀釋。如需進(jìn)行稀釋，必須遵循第4步中的方法要求，使用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋。否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中細(xì)胞因子的或重組蛋白的濃度下降，總的蛋白活性大為減弱。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步：如果要長期保存，需使用含載體蛋白（如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA）的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。

如果實(shí)驗(yàn)周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或蛋白一次用不完，則需對細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。方法：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。

經(jīng)常有客戶使用COA上推薦的溶液重懸細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉后不使用含載體蛋白的液進(jìn)行稀釋，而是直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？

答：不可以的。我們知道塑料管壁對多數(shù)蛋白均具有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的，例如ELISA的包被抗體（Capture antibody）就是通過這種粘附作用包被到酶標(biāo)板上的。

載體蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白濃度大為降低，最終表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性下降。因此，在分裝凍存時(shí)，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因?yàn)榇罅康妮d體蛋白可以保證任意濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。一般情況下，推薦的稀釋倍數(shù)是原重懸濃度的5-10倍，稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度不低于10 ug/ml。

那么，含載體蛋白的溶液是什么溶液呢？水可以嗎？

答：水是不可以的。該溶液通常是指pH接近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液（RPM1640，DMEM等）等。

還有一個(gè)經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有

BSA、FBS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，想要長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白應(yīng)該怎么辦呢？

答：一種方法是訂購Peprotech的小包裝（Size A）細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一支，用后即廢棄。如覺得此方法過于浪費(fèi)，可使用5%海藻糖（Fucose）作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已經(jīng)重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。

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