外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法

測(cè)定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。取得有活性的細(xì)胞應(yīng)根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮1細(xì)胞純度；2細(xì)胞獲得量；3細(xì)胞活力；4使用方法的簡(jiǎn)易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞。 一 原理: 常用來(lái)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W
水性高，平均分子量為
400,000，當(dāng)密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。
 二方法:
1. 在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank"s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和
Hank"s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、
中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶如下圖，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank"s液或RPMI1640，
1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。 單個(gè)核細(xì)胞濃度細(xì)胞數(shù)／1毫升細(xì)胞懸液＝ 4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù) ────────── × 10４×2稀釋倍數(shù) 4
6. 細(xì)胞活力檢測(cè)：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率。 活細(xì)胞數(shù) 活細(xì)胞百分率＝────── ×100％ 總細(xì)胞數(shù) 用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。